6月9-10日，“2018年第七屆生物育種暨高通量篩選技術(shù)理論與應(yīng)用研討會暨中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會微生物育種分會第四次學(xué)術(shù)會議”在四川成都盛大開幕。本次會議由中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會、四川省微生物學(xué)會、農(nóng)業(yè)部沼氣科學(xué)研究所、四川大學(xué)與清華大學(xué)聯(lián)合主辦，清華大學(xué)無錫應(yīng)用技術(shù)研究院生物育種研究中心、無錫源清天木生物科技有限公司、洛陽華清天木生物科技有限公司聯(lián)合承辦。本次大會吸引來自全國百余所高等科研院所專家、學(xué)者及企業(yè)技術(shù)負(fù)責(zé)人共計近300人參會。

大會現(xiàn)場

李旭峰教授致辭

清華大學(xué)邢新會教授致辭

石維忱理事長致辭

　　大會由清華大學(xué)邢新會教授主持，邢教授介紹了此次大會的相關(guān)情況，代表組委會給予各界的大力支持表示衷心的感謝。四川大學(xué)校黨委副書記李旭峰、中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會石維忱理事長代表主辦單位作了精彩致辭。在大會上作報告的部分嘉賓及內(nèi)容摘要：

　　鄭裕國院士，浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院教授。報告題目《工業(yè)生物催化劑的篩選與應(yīng)用》。內(nèi)容摘要：工業(yè)生物催化劑的篩選、發(fā)現(xiàn)與改良是工業(yè)生物技術(shù)創(chuàng)新的源頭，同時也是制約其大規(guī)模應(yīng)用的瓶頸。傳統(tǒng)的菌種篩選技術(shù)通常依賴色譜技術(shù)，處理量小、效率低、篩選周期長。如何開發(fā)高通量、高靈敏度的工業(yè)生物催化劑篩選方法是實現(xiàn)工業(yè)生物技術(shù)發(fā)展面臨的巨大挑戰(zhàn)。課題組長期從事生物催化劑的篩選、發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用研究。基于酶催化反應(yīng)特性，建立了脂肪酶、羰基還原酶、腈水解酶、腈水合酶、酰胺酶、鹵醇脫鹵酶、羥化酶和轉(zhuǎn)氨酶等系列重要工業(yè)生物催化劑的高通量篩選技術(shù)。獲得了大量適應(yīng)工業(yè)應(yīng)用環(huán)境的新型、高效生物催化劑，開發(fā)成功多個大品種藥物生物催化合成新技術(shù)，取得了顯著的經(jīng)濟(jì)、社會效益。

　　陳寧，天津科技大學(xué)教授：報告題目：氨基酸生產(chǎn)菌株選育策略與發(fā)展趨勢。內(nèi)容摘要：首先對氨基酸產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀進(jìn)行概述。然后結(jié)合課題組多年研究成果，系統(tǒng)介紹了氨基酸生產(chǎn)菌株選育技術(shù)，包括傳統(tǒng)育種、常規(guī)代謝工程育種、系統(tǒng)代謝工程育種和精確調(diào)控代謝工程育種技術(shù)。利用ARTP誘變技術(shù)和高通量篩選，獲得了一株高產(chǎn)尿苷的枯草芽孢桿菌。常規(guī)代謝工程育種策略可以概括為“進(jìn)、通、節(jié)、堵、出”五字策略。系統(tǒng)代謝工程基于途徑分析、組學(xué)分析和進(jìn)化策略。在代謝工程育種中，高效的基因組編輯技術(shù)不可或缺。最近，又開發(fā)出以CRISPR/dCas9介導(dǎo)的基因調(diào)控技術(shù)，包括基因弱化和基因強(qiáng)化表達(dá)。應(yīng)用這些手段產(chǎn)生了精確調(diào)控代謝工程育種技術(shù)。利用基因整合表達(dá)和精確調(diào)控代謝工程，我們開發(fā)出四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶高產(chǎn)菌株。最后介紹了氨基酸菌株選育的發(fā)展新方向。

　　張翀，清華大學(xué)副教授。報告題目：微生物基因型－表型高通量關(guān)聯(lián)技術(shù)與裝備。內(nèi)容摘要：盡管在許多化學(xué)品綠色合成路線替代方面取得了重要進(jìn)展，微生物制造仍面臨諸多挑戰(zhàn)：菌種研發(fā)周期長、大多數(shù)品種生產(chǎn)效率（轉(zhuǎn)化率、時空產(chǎn)率）仍然很低，無法滿足未來制造業(yè)“按需定制”、“高效柔性”的發(fā)展需求。下一代基因測序和核酸合成等高通量技術(shù)，結(jié)合合成生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化、模塊化的策略為高效快速構(gòu)建豐富多樣的微生物基因型（甚至人工合成基因組）創(chuàng)造了重要機(jī)遇，然而表型（功能）才是實現(xiàn)微生物應(yīng)用核心問題，如何從海量的基因型中高效、快速獲取表型及其關(guān)聯(lián)信息仍然面臨巨大挑戰(zhàn)。本報告將介紹近年來我們在微生物基因型－表型高通量關(guān)聯(lián)平臺技術(shù)與裝備方面的進(jìn)展，包括基于液滴微流控和小分子生物傳感的微生物工業(yè)表型高通量連續(xù)進(jìn)化技術(shù)；全基因組CRISPR干擾庫篩選、核酸序列深度突變掃描等微生物基因型功能深度挖掘技術(shù)；以及我們在上述技術(shù)系統(tǒng)化、設(shè)備化方面的嘗試。

　　楊廣宇，上海交通大學(xué)研究員。報告題目：基于單細(xì)胞超高通量篩選的酶基因快速定向進(jìn)化。內(nèi)容摘要：應(yīng)用合成生物學(xué)構(gòu)建高效的人工生物催化體系需要具有理想功能的酶，定向進(jìn)化是人工優(yōu)化和塑造酶功能的重要途徑，但其效率受限于對突變庫進(jìn)行高通量篩選。近年來，我們使用直徑僅有幾微米的微液滴作為微型酶反應(yīng)器，發(fā)展了基于熒光激活微液滴分選（Fluorescence-activateddropletsorting，F(xiàn)ADS)的超高通量篩選系統(tǒng)，可以在流式細(xì)胞儀或微流控芯片上以極高的速度對酶活性進(jìn)行定量分析與篩選。針對FADS對熒光底物的特殊要求，我們提出了熒光液滴捕獲（Fluorescence droplet entrapment，F(xiàn)DE）底物設(shè)計原則，并針對一系列重要工業(yè)酶合成了FADS專用熒光探針。近期，我們建立了首個可直接對酶底物選擇性、立體選擇性等復(fù)雜性質(zhì)進(jìn)行篩選的雙通道微流控液滴分選系統(tǒng)(Dual-channelmicrofluidic droplet screening,DMDS)，該系統(tǒng)將液滴檢測和篩選部件集成在一塊微流控芯片上，能夠以1300個克隆/秒的高速度同時對兩種熒光信號進(jìn)行檢測。利用DMDS系統(tǒng)，我們對布洛芬酯酶進(jìn)行了5輪定向進(jìn)化，從近500萬個隨機(jī)突變體中篩選獲得了立體選擇性提高700倍的突變酶，展示了這一體系在酶功能優(yōu)化方面的能力。目前我們正在通過設(shè)計新的熒光底物、構(gòu)建多酶級聯(lián)熒光檢測系統(tǒng)等手段，進(jìn)一步擴(kuò)展FADS篩選體系的應(yīng)用范圍，以期它在酶工程、代謝工程、合成生物學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮更大作用。

　　彭方，武漢大學(xué)副教授。報告題目：質(zhì)譜在微生物鑒定及高通量篩選中的應(yīng)用。內(nèi)容摘要：基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（Matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry , MALDI-TOF MS）是21世紀(jì)發(fā)展起來的一種新型軟電離質(zhì)譜技術(shù)，對生物大分子進(jìn)行識別和結(jié)構(gòu)分析的方法。作為一種新興的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)及相關(guān)領(lǐng)域，也是一項新興的微生物鑒定技術(shù)，與傳統(tǒng)鑒定方法相比MALDI-TOF MS具有操作簡便快速，高通量、低成本、準(zhǔn)確等特點。通過微生物質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的建立，MALDI-TOF MS能準(zhǔn)確鑒定大部分細(xì)菌和真菌，特別是對一些相似度高、檢測過程復(fù)雜的菌株進(jìn)行快速、精確的鑒定。另外，利用對MALDI-TOF質(zhì)譜圖譜的聚類和比較分析，可以對微生物的不同菌株或不同功能活性的菌株進(jìn)行高通量篩選和質(zhì)量控制。

　　李晚忱，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所教授。報告題目：常壓室溫等離子體誘導(dǎo)玉米矮稈突變。內(nèi)容摘要：常壓室溫等離子體是集多種誘變因素的第四態(tài)射流，可改變細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和通透性，誘發(fā)DNA突變。在多種微生物誘變育種上應(yīng)用，培育出生產(chǎn)效能更高的工業(yè)菌株。我們用改進(jìn)的植物誘變等離子體發(fā)生器處理玉米萌動種子，獲得顯性突變矮稈株系。DNA重測序表明，按基因組全部堿基對計算，突變率0.083%，高于化學(xué)誘變突變率。雖然已有數(shù)十個玉米矮稈突變體及相關(guān)基因的報道，但大多屬隱性單基因突變或表現(xiàn)畸形，一些數(shù)量性狀位點致矮力不強(qiáng)，在雜交種組配中很難利用。少數(shù)數(shù)量性狀位對株高的降低程度適中，對產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀無明顯不良影響，但僅有少數(shù)成功克隆和功能驗證報道。為發(fā)掘更多矮稈基因型，解析矮化機(jī)理，擴(kuò)增玉米株型育種種質(zhì)，本項目擬結(jié)合運用常規(guī)遺傳育種與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，在驗證等離子體對植物誘變效果的同時，鑒定矮稈突變株系的致矮力、配合力及綜合農(nóng)藝性狀表現(xiàn)，評價矮稈突變株系在玉米雜交種選育中的利用潛勢。

　　侯吉倫，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心實驗站副研究員。報告題目：基于ARTP的牙鲆種質(zhì)資源創(chuàng)新研究。

　　彭衛(wèi)紅，四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究員。報告題目：名貴珍稀食用菌羊肚菌的馴化栽培及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)。內(nèi)容摘要：對課題組承擔(dān)的名貴珍稀食用菌羊肚菌的馴化、配套關(guān)鍵技術(shù)研究及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的現(xiàn)狀、問題和趨勢等進(jìn)行回顧和總結(jié)。

　　高程海，廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究員。報告題目：基于ARTP方法篩選具有抑制甘蔗鞭黑粉菌活性的海綿共生細(xì)菌突變株研究。內(nèi)容摘要：甘蔗是一種一年生或多年生熱帶和亞熱帶草本植物。中國是世界第3大甘蔗生產(chǎn)大國，2016年甘蔗種植面積152.7萬公頃，甘蔗產(chǎn)量約11382.5萬噸。對甘蔗年產(chǎn)量制約最大的生物因素為甘蔗鞭黑粉菌引起的甘蔗黑穗病，其已成為世界上最棘手和具有毀滅性的甘蔗病害。由于品種單一、旱地種植和宿根蔗占比大，以及對蔗種消毒和蔗田病害防治不夠重視，造成中國甘蔗黑穗病發(fā)生率逐年增加。依據(jù)發(fā)病程度不同，甘蔗黑穗病一般引起甘蔗產(chǎn)量損失10%-30%，發(fā)病嚴(yán)重的甚至可達(dá)到50%-70%，給中國蔗糖生產(chǎn)帶來巨大的安全隱患。利用常壓室溫等離子體（ARTP）誘變育種儀，在誘變條件：功率120W，間距2mm，氣量10SLM，處理時間175s下誘變B.siamensis，后經(jīng)篩選得到一株穩(wěn)定高產(chǎn)化合物A的突變菌A72，其活性成分產(chǎn)量為38.0496 µg/mL，比原始菌株增加52.8%。利用蛋白組學(xué)的方法分析化合物A處理后菌體中蛋白變化，以1.3倍為變化閾值，t-test p-value<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)差異蛋白533個，后經(jīng)分析GO、KEGG通路分析，從中篩選出目的蛋白8個，結(jié)合蛋白功能初步推測化合物A主要通過影響氧化磷酸化代謝過程來達(dá)到抑制效果。

　　蘇海佳，北京化工大學(xué)教授。內(nèi)容題目：綠色生物制造-復(fù)雜原料多細(xì)胞體系的人工構(gòu)建。內(nèi)容摘要：針對工業(yè)含糖廢水、農(nóng)業(yè)廢水、餐廚垃圾等復(fù)雜底物體系，以微生物營養(yǎng)調(diào)控與代謝機(jī)理為關(guān)鍵科學(xué)問題，通過構(gòu)建人工多細(xì)胞體系，從細(xì)胞、代謝、基因及轉(zhuǎn)錄水平對其協(xié)同作用進(jìn)行深入剖析，揭示多菌群在復(fù)雜底物體系中生長代謝過程中物質(zhì)、調(diào)控和信息傳遞規(guī)律，闡明復(fù)雜底物體系高效轉(zhuǎn)化/利用與多細(xì)胞體系協(xié)同效應(yīng)機(jī)制。

　　堵國成，江南大學(xué)教授。內(nèi)容題目：新一代工業(yè)生物技術(shù)中的高通量篩選技術(shù)與應(yīng)用。內(nèi)容摘要：報告概述了新一代發(fā)酵工程技術(shù)的研究進(jìn)展，介紹了高通量篩選平臺技術(shù)發(fā)展情況、應(yīng)用領(lǐng)域和高通量培養(yǎng)條件優(yōu)化平臺的特點，重點介紹了高通量篩選在工業(yè)生物技術(shù)中的成功應(yīng)用實例，并對高通量篩選技術(shù)應(yīng)用進(jìn)行了展望。

　　易犁，湖北大學(xué)教授。報告題目：分子改造促進(jìn)蛋白在大腸桿菌和畢赤酵母中的異源分泌表達(dá)。內(nèi)容摘要：蛋白在大腸桿菌和畢赤酵母中的異源分泌表達(dá)能有效簡化蛋白分離提取步驟，從而降低蛋白的工業(yè)生產(chǎn)成本。近來，我們通過開發(fā)新型分泌引導(dǎo)蛋白，以及對分泌引導(dǎo)蛋白前段信號肽和細(xì)胞壁構(gòu)成進(jìn)行分子改造有效提高了木聚糖酶、精氨酸酶、單鏈抗體等蛋白在大腸桿菌中的分泌表達(dá)；并通過輔助因子的共表達(dá)有效提升了人源溶菌酶在畢赤酵母中的分泌表達(dá)。

　　其中，通過在冰核蛋白氨基端添加多聚谷氨酸或多聚賴氨酸，從而能夠有效增加其融合表達(dá)精氨酸酶的胞外分泌量。而運用一種超折疊GFP（sfGFP）作為新的融合蛋白標(biāo)簽，也能夠促進(jìn)內(nèi)切β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶H（Endo H）、精氨酸酶I（ARG1）、谷氨酸脫羧酶（GAD）、抗菌肽PG4等蛋白和多肽在大腸桿菌中的分泌表達(dá)，使它們的分泌表達(dá)量分別達(dá)到了0.471 g/L、0.397 g/L、0.198 g/L、0.121 g/L。此外，通過敲除類脂A合成相關(guān)基因LpxM，利用Sec途徑分泌信號肽使木聚糖酶在大腸桿菌中的簡單分泌成為可能，其胞外蛋白分泌濃度達(dá)到了0.12 g/L，活性達(dá)到3415 U/mL。同時，我們也對酵母細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體介導(dǎo)的蛋白分泌途徑進(jìn)行深層次解析，并采用輔助因子協(xié)同表達(dá)等策略有效促進(jìn)了溶菌酶等高經(jīng)濟(jì)價值蛋白在畢赤酵母中的分泌表達(dá)。例如，利用基因劑量效應(yīng)和輔助因子Pdi1，使人源溶菌酶在畢赤酵母中的分泌表達(dá)量達(dá)到了0.24 mg/mL，其針對溶壁微球菌的活性高達(dá)14120 U/mL。

　　鄧禹，江南大學(xué)教授。內(nèi)容題目：大腸桿菌中高產(chǎn)己二酸代謝途徑的重建。內(nèi)容摘要：己二酸是一種重要的二元羧酸，當(dāng)前最重要的應(yīng)用領(lǐng)域是合成尼龍類纖維（比如尼龍6,6）。預(yù)計到2018年，己二酸全球的市場價值將達(dá)到63億美元，產(chǎn)量約25.6億公斤。工業(yè)上己二酸的生產(chǎn)路線主要是硝酸氧化法，但其工藝流程長，副產(chǎn)物較多，污染嚴(yán)重。因此人們迫切需要尋找一種綠色，環(huán)保合成己二酸的方法。在微生物中直接生產(chǎn)己二酸的途徑是不存在的，人們開始合成己二酸的前體順，順-粘康酸，但順，順-粘康酸到己二酸需要金屬鉑等化學(xué)催化劑催化，因此限制了發(fā)展。進(jìn)而人們開始探索己二酸的全生物合成途徑，美國的Genomatica公司和Verdezyne公司是該研究領(lǐng)域的領(lǐng)跑者，但是卻沒有透露己二酸的具體產(chǎn)量和產(chǎn)率。以往的研究均是從不同的底物間接合成己二酸，產(chǎn)量、產(chǎn)率低。而本研究是以之前在Thermobifidafusca中發(fā)現(xiàn)的3-氧代己二酰輔酶A途徑為基礎(chǔ)，通過密碼子優(yōu)化6種己二酸合成過程中所需酶的基因，然后將構(gòu)建好的質(zhì)粒導(dǎo)入BL21（DE3）中進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀及核磁鑒定為己二酸。出發(fā)菌株Mad136可產(chǎn)0.3g/L己二酸（轉(zhuǎn)化率為13.9%），并經(jīng)確定5-Carboxy-2-pentenoyl-coa還原酶（Tfu_1647）為逆降解途徑的關(guān)鍵酶。隨后使用pTrc99a過量表達(dá)Tfu_1647基因，最終形成Mad146菌株，可產(chǎn)生4.3g/L己二酸，轉(zhuǎn)化率為55.5%。為了進(jìn)一步的提高產(chǎn)量，本實驗利用CRISPR/Cas9消除途徑的主要次級代謝產(chǎn)物以減少碳通量競爭和敲除琥珀酸輔酶A合成酶基因以促進(jìn)琥珀酰輔酶A的積累，從而增加己二酸合成的前體，最終形成菌株Mad123146。此菌株可利用甘油發(fā)酵可產(chǎn)生68.0g/L己二酸，比初始菌株提高了225倍，為報道的最高值。